Máy PCR là gì? Quy trình hiệu chuẩn máy PCR

Máy PCR là gì? Quy trình hiệu chuẩn máy PCR


Máy PCR là gì? hoặc Realtime PCR?

PCR là chữ viết tắt của cụm từ tiếng anh (Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân bản một đoạn ADN lên gấp nhiều lần trong phòng thí nghiệm. Kỹ thuật này sử dụng một số enzyme tham gia quá trình tái bản ADN trong tự nhiên như ADN polymerase. Tuy nhiên trong tự nhiên để tách và giãn xoắn hai chuỗi ADN ra tế bào sử dụng các enzyme chuyên biệt như Helicase và Topoisomerase. Trong thực tế khi thực hiện kỹ thuật PCR các nhà khoa học sử dụng nhiệt độ để tách chuỗi, gắn mồi vào các sợi ADN đích. Do đó các phản ứng PCR được diễn ra trong máy PCR hay còn gọi là máy gia nhiệt hay luân nhiệt. Máy PCR cần đảm bảo kiểm soát nhiệt độ chính xác, thay đổi nhiệt độ nhanh chóng để hiệu quả nhân gen là tốt nhất. Do đó việc lựa chọn máy PCR là tối quan trọng để đem tới hiệu quả cao nhất.

Kỹ thuật PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật, virut gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử, chẩn đoán bệnh do virus, vi khuẩn gây bệnh,…

Máy tách chiết tự động RT-PCR
Hình ảnh máy PCR

Cấu tạo máy PCR?

Mỗi loại máy PCR lại có cấu tạo khác nhau. Quá trình sử dụng chúng ta có thể lựa chọn PCR với 2 hoặc 3 block, một block thông thường 96 giếng, hoặc cũng có thể lựa chọn các loại máy PCR cầm tay để đem đi hiện trường. Quá trình hiệu chuẩn ở nhiều Trung tâm nghiên cứu hay Bệnh viện lớn họ thường xây dựng series nhiều máy luân nhiệt được liên kết với nhau để tạo ra một hệ thống máy PCR lớn và được điểu khiển bởi một hệ thống máy tính trung tâm.

Nguyên lý hoạt động máy PCR?

Nguyên lý hoạt động của máy PCR là việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ và được lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ được diễn ra theo 3 bước:

Bước 1: Biến tính tách đôi sợi DNA: Được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 950C) trong vòng 30 – 60 giây. Lúc này, phân tử DNA mạch kép sẽ được tách thành hai mạch đơn (đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới).

Bước 2: Bắt cặp mồi: Được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các Primer, nhiệt độ dao động trong khoảng 55 – 650C. Thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây tùy vào Tm của các primer.

Bước 3: Kéo dài: Được thức hiện ở nhiệt độ 72 0C giúp cho DNA polymerase có môi trường hoạt động tốt nhất. Lúc này, dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide sẽ lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại.

Nguyên lý phản ứng PCR
Nguyên lý phản ứng PCR

Qua 3 bước, một DNA đích sẽ được nhân lên thành hai bản sao và chu kỳ được lặp đi lặp lại liên tục từ 30 – 40 chu kỳ. Lúc này, từ một DNA đích sẽ nhân lên thành 230 đến 240 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao.

>> Xem thêm: Một số thuật ngữ cơ bản sử dụng trong sinh học phân tử chẩn đoán lâm sàng

Quy trình hiệu chuẩn máy PCR?

Quá trình hiệu chuẩn máy PCR hoặc realtime PCR lần lượt tiến hành các phép hiệu chuẩn sau:

Bước 1. Chuẩn bị hiệu chuẩn
Trước khi tiến hành hiệu chuẩn phải thực hiện các công việc sau đây: Vệ sinh máy và kiểm tra hoạt động của máy theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, chuẩn bị các cặp nhiệt điện rồi đặt đầu của cặp nhiệt điện vào máy PCR, sau đó dùng vật liệu cách nhiệt lắp kín ngõ vào, các đầu của cặp nhiệt điện được đặt cố định phân bổ đều trong máy, lắp các cặp nhiệt điện vào máy đo theo đúng vị trí các kênh (xem số ghi trên đầu của cặp nhiệt điện) ghi nhiệt độ theo các kênh tương ứng.

Bước 2. Kiểm tra bên ngoài
Kiểm tra bên ngoài theo các yêu cầu sau đây: Xem xét và ghi các thông tin về tên, nhãn hiệu, kiểu /loại, số hiệu, chỉ thị nhiệt độ của phương tiện đo, phạm vi hoạt động, độ phân giải của nhà sản xuất.

Bước 3. Kiểm tra kỹ thuật
Kiểm tra kỹ thuật theo các yêu cầu sau đây: Bộ chỉ thị nhiệt độ hoạt động ổn định, không có hiện tượng thay đổi đột ngột, biến động, các số hiển thị phải rõ nét, không bị mờ hoặc mất nét.

Bước 4. Kiểm tra đo lường
Máy PCR được kiểm tra đo lường theo trình tự các nội dung, phương pháp và các yêu cầu sau đây:
– Số điểm nhiệt độ được chia đều trong dải nhiệt độ cần hiệu chuẩn và không ít hơn 2 điểm; hiệu chuẩn từ điểm thấp đến điểm cao nhất.
– Đặt nhiệt độ bể nhiệt của máy PCR ở nhiệt độ cần hiệu chuẩn và cho máy hoạt động.
– Sau khi nhiệt độ đạt trạng thái ổn định (quan sát bộ chỉ thị nhiệt của máy thấy giá trị nhiệt độ không thay đổi hoặc nhiệt độ dao động xung quanh một giá trị tương ứng hoặc lân cận với giá trị nhiệt độ được cài đặt).

– Tiến hành ghi giá trị nhiệt độ tj của bộ chỉ thị và các giá trị tij của từng vị trí của nhiệt kế chuẩn. Ghi nhận kết quả hiệu chuẩn này làm nhiều lần trong khoảng thời gian cỡ 30 phút, số lần ghi nhiệt độ sao cho đủ để xác định được nhiệt độ cực đại, cực tiểu và trung bình của chuẩn.
– Quá trình đọc số chỉ từ bộ hiển thị của UUT đến nhiệt kế chuẩn thứ 1, lần lượt đến nhiệt kế chuẩn thứ n về lại bộ chỉ thị của UUT là một lượt đọc. Số lượt đọc tại mổi điểm kiểm tra không ít hơn 3 lần.
– Lần lượt kiểm tra ở các điểm tiếp theo.
– Độ hồi trễ của UUT (Amax) sẽ được tính tại điểm hiệu chuẩn nào có giá trị trung bình sai lệch lớn nhất theo chiều hiệu chuẩn tăng và giảm nhiệt độ.
Quá trình kiểm tra đo lường đánh giá các chỉ tiêu: Xác định sai số của chỉ thị, kiểm tra độ ổn định, kiểm tra độ đồng đều, độ chênh lệch, độ hồi trễ tại mỗi điểm hiệu chuẩn và tính toán độ không đảm bảo đo.

Bước 5. Xử lý kết quả
– Máy PCR đạt tất cả các yêu cầu kiểm tra được dán tem hiệu chuẩn và cấp giấy chứng nhận hiệu chuẩn.
– Chu kỳ hiệu chuẩn được khuyến nghị là 1 năm.

Vì sao phải hiệu chuẩn máy PCR?

Do các phản ứng PCR được diễn ra trong máy PCR với nhiệt độ cài đặt theo từng chu trình, phải đảm bảo “kiểm soát” nhiệt độ chính xác và thay đổi nhiệt độ nhanh chóng để hiệu quả nhân gen tốt nhất. Như vậy, chỉ tiêu nhiệt độ là chỉ tiêu cần phải kiểm tra định kỳ trong máy PCR hay nói khác hơn máy PCR cần phải hiệu chuẩn nhiệt định kỳ theo tần suất sử dụng, khuyến cáo là 1 lần/năm.

Nguồn: https://kiemdinhvung3.com/

0901 681 202